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在放射性同位素實驗中，所引用的放射性標記化合物的化學量是極微量的，它對體內原有的相應物質的重量改變是微不足道的，體內生理過程仍保持正常的平衡狀態，獲得的分析結果符合生理條件，更能反映客觀存在的事物本質。 放射性同位素示蹤法的優點如上所述，但也存在一些缺陷，如從事放射性同位素工作的人員要受一定的專門訓練，要具備相應的安全防護措施和條件，在目前個別元素（如氧、氮等）還沒有合適的放射性同位素等等。在作示蹤實驗時，還必須注意到示蹤劑的同位素效應和放射效應問題。所謂同位素效應是指放射性同位素（或是穩定性同位素）與相應的普通元素之間存在著化學性質上的微小差異所引起的個別性質上的明顯區別，對于輕元素而言，同位素效應比較嚴重。因為同位素之間的質量判別是倍增的，如3H質量是1H的三倍，2H是1H的兩倍，當用氚水（3H2O）作示蹤劑時，它在普通H2O中的含量不能過大，否則會使水的物理常數、對細胞膜的滲透及細胞質粘性等都會發生改變。但在一般的示蹤實驗中，由同位素效應引起的誤差，常在實驗誤差內，可忽略不計。放射性同位素釋放的射線利于追蹤測量，但射線對生物體的作用達到一定劑量時，會改變機體的生理狀態，這就是放射性同位素的輻射效應，因此放射性同位素的用量應小于安全劑量，嚴格控制在生物機體所能允許的范圍之內，以免實驗對象受輻射損傷，而得錯誤的結果。

二、標記實驗的設計原則

設計一個放射性同位素的標記實驗應從實驗的目的性，實驗所具備的條件和對放射性的防護水平三方面著手考慮。原則上必須從兩個主要方面來設計放射性標記實驗：一是必須尋求有效的、可重復的測定放射性強度的條件，二是必須選擇一個合適的比活度λqδ（單位是原子/時間/分子氚標記，dpm/mol或ci/mol）。其中，λ=-dN’dt/N’為該處放射性原子核的衰變常數。q=N ’/n’，表示n’個該化學形式分子為N’個放射性原子所標記。δ=n’/n表示放射性標記的分子數n’與總分子數（標記的加未標記的）n之比。采用放射性同位素標記技術來實現所研究課題預期目的全部或一部分，一般須經過實驗準備階段，實驗階段和放射性廢物處理三個步驟。

（一）實驗準備階段

1.標記劑的選擇

選定放射性標記劑的比活度λqδ的值必須足夠大，以保證實驗所需要的靈敏度，而又要盡可能地小，使得在該實驗條件下輻射自分解可忽略。一般情形是根據實驗目的和實驗周期長短，來選擇具有合適的衰變方式，輻射類型和半衰期，且放射毒性低的放射性同位素。至今已確定的放射性核素包括天然的58種和人工制造的約1300種，其中大多數不常能用作放射性標記劑。主要原因是制備困難、半衰期不合適及放射性不足以定量。在任何一種生產方法中，生產步驟很可能包含或多或少的化學處理，因而標記實驗人員需要了解某個核素及其周圍的那些元素的化學性質，因為它們有可能成為此放射性同位素的雜質。

放射性同位素都衰變（經過或不經過中間狀態）到處于基態的子體核素，衰變時伴隨各種形式的能量輻射，如α、β-、β+、γ、X放射等。在選擇標記劑時，標記實驗人員要仔細研究衰變綱圖，根據實驗條件和計數條件來決定那一種輻射，在衰變綱變內，代表核能級的兩條水平線之間和距離表示能量差，↑或↓表示能級同伴隨原子序數增或減少的能量，↓表示從激發態至基態的同質異能躍遷。一般要選擇最適宜的半衰期τ的放射性同位素，使τ足夠長，從而使衰變校正有意義或干脆不必作衰變校正，同時又要足夠短，能較安全地進行標記實驗汽油報警器，并使得放射性廢物容易處理，在實際工作中，使用的放射性同位素的半衰期應該與實驗需要持續的時間t相適應，如對于某個實驗，t/τ=0.04時，應所選放射性同位素的衰變校正為3.5%；而t/τ=0.10時，應選放射性同位素的衰變校正為6.6%。t/τ=0.15時，應選用其衰變校正為10%。

在體外標記條件，一般選用半衰期較長而射線強度適中，既利于探測，又易于防護和保存的放射性標記劑。體內標記條件下，若實驗周期短，應選用半衰期短，且能放出一定強度r射線物放射性同位素，若實驗周期長，如需要將動物活殺后對組織臟器分別測定的，則應選用半衰期較長放射性同位素。此外，根據實驗目的來選用定位的或不定位的標記標記劑，例如研究氨基酸的脫羧反應，14C應標記在羧基上，只有這種定位標記的氨基酸，才能在脫羧后產生14CO2。而有些實驗不要求特定位置標記，只須均勻標記即可。

選擇放射性標記劑還必須同時滿足高化學純度，高放射性核純度的要求。在標記劑制備期間、貯存期間以用試驗體系中所使用的溶劑、化學試劑、酶等可能會產生化學雜質、放射化學雜質及輻射自分解引起的放射性雜質，這些雜質的存在，使得標記實驗中使用的標記劑不“純”，而或多或少影響實驗的結果，甚至會導致錯誤結論。 氚標記的胸腺嘧啶核苷（3H－TdR）和尿嘧啶核苷（3H－UR）是兩種常用的標記劑，前者有效地結合到DNA中，后者則摻入到RNA中，它們的輻射分解速度隨比較放射性的增高及保存時間的延長而增加，在不同溫度和不同溶液中的穩定性也不同。經保存八年的3H-TdR約有35%輻射分解為3H－胸腺嘧啶，并導致二醇和水合物的形式，在實驗中這雜質會很快摻入細胞并與大分子（很可能是蛋白質）結合，而不是與DNA和RNA相結合，這些雜質用DNA酶和RNA酶處理細胞都不除去。3H－TdR和3H－UR貯存在-20℃的冷凍溶液中輻射分離速度要比+2℃增加3－4倍，但低溫度（-140℃）對貯存也有利，在允許對標記實驗人員在選擇保存放射性標記劑時會有所啟發。

2.放射性同位素測量方法的選擇

測量方法的選擇取決于射線種類，對于α射線通常可用硫化鋅晶體、電離室、核乳膠等方法探測；對能量高的β射線可用云母窗計數管、塑料閃爍晶體及核乳膠測定，對于能量低的β射線可用液體閃爍計數器測量：對于γ射線則用G-M計數管，碘化鈉（鉈）閃爍晶體探測。目前大多數實驗室主要采用晶體閃爍計數法和液體閃爍計數法兩種測量方式。

同一臺探測儀器對不同量的標記劑具有不同的最佳工作條件，在實驗準備階段要檢查探測器是否已調有所用標記同位素的工作條件，否則需要用一定量的標記劑作為放射源（或選用該同位素的標準源），把探測器的最佳工作條件調整好，并且要保證探測器性能處于穩定可靠的狀態。

探測最佳工作條件的選擇方法：一種是測“坪曲線”，另一種是找最好的品質因素。對于光電倍增管，在理論上不存在“坪”（plateau）。但隨著高壓的增加，在一定范圍內，脈沖數變化較小，形成一段坡度較小的電壓脈沖曲線，通常也稱其為坪。測坪曲線的方法：固定放射源，根據其射線能量的大小，初選 一個廣大器增益（放大倍數）和甄別器閾值。不斷地改變高壓（由低到高，均勻增加伏度），每改變一次高壓，都測定一次本底和放射源的計數率，最后作出高壓本底計數率和高壓放射源計數曲線。用同樣的方法，作另一個甄別閾值（放大倍數不變）下的高壓計數率曲線，這樣反復多作幾條曲線。必要時，還可固定甄別閾值，改變放大倍數，求出高壓計數率曲線。應選擇“坪”比較平坦的曲線工作條件：甄別閾值和放大增益，作為正式測定時間的儀器工作條件，高壓值應選擇在該“坪”中點偏向起始段一邊相應的高壓值。品質因素，又稱為優值，是指在一定條件下，要達到合適的統計數目所需要的時間是儀器的計數效率E和本底計數Nb的函數： 品質因素F=E2/Nb它是衡量一臺計數器性能的指標，儀器的品質因素F應該越大越好，品質因素F越大，表示測量效率E越高而本底Nb越小。如果某放射性標記的標準源存在來源困難等問題的話，可以用相對品質因素f來代替。 相品質因素f=ns/nb 式中ns指某種放射性樣品的計數率。找最好品質因素的方法與測坪曲線一樣，作出幾條高壓－F（或f）的關系曲線，在幾條曲線中選擇峰值最高的曲線。這根曲線的峰值所對應的條件：高壓，甄別閾，放大倍數等，就是該儀器對被測同位素的最佳工作條件。最佳品質因素不一定恰好落在“坪”上，有的在“坪”附近，有的卻在“坪”的下端。著眼于把同位素的整個能譜峰都計下來的標記實驗者主張取“坪”所對應的工作條件，而著眼于優值者，主張取最佳品質因素所對應的工作條件，也有人折衷。如果某儀器本底很低，光電倍增管噪音很低和能譜分辯高，二者應該相差不大。同一臺儀器的最佳工作條件，隨儀器的使用期延長而有所改變，不同的放射性同位素，其最佳工作條件不同。因此核探測儀器的最佳工作條件具有專屬性，并且要經常通過選擇其不同時期的最佳工作條件。更不能不問被測同位素的種類，而千篇一律地使用同一個工作條件。

為了達到準確地計數，可以長時間一次計數，或短時間多次測量，兩者達到的標準誤基本相同，為避免外界因素的影響，在實際工作中，取短時間多次測量較為合理適用。在測量樣品的放射性時，本底是一個重要影響因素。本底高，則標準誤和標準誤差都增大，尤其在樣品計數較低時，本底對標準誤和標準誤差的影響就愈大，從而影響實驗結果的精度，而且為了達到一定的精度，勢別要增加樣品的測量時間。根據核衰變的統計規律，在實驗中如果樣品數量少，選擇tN=1.4tb的比例（式中tN為樣品放射性測量時間，tb為本底測量時間）較為合理；如果樣品數量較多是一大批樣品，則延長本底測量時間tb，取tb的時間均值，而tN則可相對短氧氣檢測儀，這樣可節省時間，有利于縮短實驗周期。對于標記實驗設計來說，樣品中所含放射性強度的要求，是使其放射性計數率大于或等于本底計數的10－20倍。

3.進行非放射性的模擬實驗，把實驗全過程預演一遍

同位素標記實驗要求準確、仔細，稍有疏忽或考慮不周就匆忙進行正式實驗，既容易導致實驗失敗，又會造成標記劑和其它實驗用品的浪費，還會增加放射性廢物，增加實驗室本底水平，使實驗者接受不必要的輻射劑量，所以模擬實驗不僅可以檢查正式實驗中所用器材，藥品是否合格，又可以操作人員進行訓練，以保證正式實驗能順利進行。

（二）正式實驗階段

1.選擇放射性同位素的劑量

同位素必須能經得起稀釋，使其最后樣品的放射性不能低于本底，一般來說放射性同位素在生物體內不是完全均勻地被稀釋，可能在某些器官、組織、細胞、某些分子中有選擇性地蓄積，蓄積的部分放射性就會很強，在這種情況下，應以相關部位對標記劑的蓄積率來考慮標記劑用量。在細胞培養，切片保溫，酶反應等標記實驗中，應依據實驗目的、反應時間及反應體積的不同來考慮標記劑的用量，通常小于一個微居里或幾個微居里。 由于放射性同位素存在輻射效應，應該根據使用的放射性核素的種類，將用量控制在最大允許劑量之內（maximun permissible dose），以免因劑量過大所造成的輻射效應，給實驗帶來較大的誤差。

2.選擇標記劑給入途徑

整體標記實驗時，應根據實驗目的，選擇易吸收、易操作的給入途徑，一般給予的數量體積小，要求給予的劑量準確，防止可能的損失和不必要的污染。體外標記實驗時，應根據實驗設計的實驗步驟的某個環節加入一定劑量的標記到反應系統中去，力求操作準確，仔細。

3.放射性生物樣品的制備

根據實驗目的和標記劑的標記放射性同位素的性質制備放射性生物樣品，其中放射性同位素的性質是生物樣品制備形式的主要依據。若是釋放r射線的標記劑，則樣品制備比較容易，只要定量地取出被測物放入井型NaI（TL）晶體內就能測定；若是釋放出硬β射線的標記劑，須將生物樣品制成厚度較薄的液體，或將液體鋪樣后烘干，也可灰化后鋪樣，放入塑料晶體閃爍儀內測定，或用鐘罩型蓋一革計數管探測；若標記同位素僅釋放軟β射線，那么樣品應制成液體閃爍樣品（詳見放射性測量”一章），在液體閃爍計數器內測量。不論采用何種測量方法，都應該對樣品作定量采集。對某些放射性分散的樣品，應當作適當濃集，如測定組織內蛋白質的放射性，應對蛋白質作提取處理然后制備成相應的測量樣品。有些樣品需采用灰化法，但灰化法對易揮發的同位素或易揮發的組織樣品不合適。

4.放射性樣品的測量

測量方法分為絕對測量和相對測量。絕對測量是對樣品的實有放射性強度作測量，求出樣品中標記同位素的實際衰變率，在作絕對測量時，要糾正一些因素對測量結果的影響，這些因素包括儀器探頭對于放射源的相對立體角、射線被探頭接收后被計數的幾率、反散射、 放射源的自吸收影響等等。而相對測量只是在某個固定的探測儀器上作放射性強度的相對測量，不追求它的實際衰變率。在一般的標記實驗中，大多采用相對測量的方法，比較樣品間的差異。在相對測量時，要注意保持樣品與探測器之間的幾何位置固定。幾何條件的影響是放射性測量中最重要的影響因素。當兩個放射性強度相同的樣品在測量中所置的幾何位置不一，或樣品制備過程造成的幾何條件差異，其計數會相差很多，尤其當樣品與探頭之間距離較近時，兩者計數率相差會很大。但是當樣品與探頭之間相距較遠時，由于樣品與探頭之間形成的相對立體角較小，所以兩者計數率的差異會顯著減小。在用紙片法測量3H標記物的放射性強度時，要注意紙片在閃爍瓶中的位置，一批樣品應該一致，如果是將濾紙剪成圓狀作支持物，圓片的直徑最好與閃爍瓶底的直徑相等，保證濾紙在閃爍瓶內的位置固定。減小幾何條件對放射性測量的影響可以從三方面入手：⑴選擇探測窗大的探測器，如光電倍增管作探頭的探測器；⑵在樣品制備時，注意盡量將樣品做成點狀源，這樣當樣品的放射性強度較弱時，由于距離探測窗較近而有可能造成的水平位移的影響就可以忽略；⑶無論樣品距離探測窗遠近，樣品都應置于探測窗的垂直軸線上，以減少樣品與探測窗之間的相對立體角。

（三）放射性去污染和放射性廢物處理

放射性實驗，無論是每次實驗或階段性實驗結束后，都可能有不同程度的放射性污染和放射性廢物的出現，因此，在實驗結束后，要作去污染處理和放射性廢物處理。必要時在實驗過程進行中，就要作除污染和清理放射性廢物的工作。

三、同位素標記法在生物化學和分子生物學中的應用

放射性同位素標記法在生物化學和分子生物學領域應用極為廣泛氚標記，它為揭示體內和細胞內理化過程的秘密，闡明生命活動的物質基礎起了極其重要的作用。近幾年來，同位素標記技術在原基礎上又有許多新發展，如雙標記和多標記技術，穩定性同位素標記技術，活化分析，電子顯微鏡技術，同位素技術與其它新技術相結合等。由于這些技術的發展，使生物化學從靜態進入動態，從細胞水平進入分子水平，闡明了一系列重大問題，如遺傳密碼、細胞膜受體、RNA-DNA逆轉錄等，使人類對生命基本現象的認識開辟了一條新的途徑。下面僅就同位素標記技術在生物化學和分子生物學中應用的幾個主要方面作一介紹。

1.物質代放謝的研究

體內存在著很多種物質，究竟它們之間是如何轉變的，如果在研究中應用適當的同位素標記物作標記劑分析這些物質中同位素含量的變化，就可以知道它們之間相互轉變的關系，還能分辯出誰是前身物，誰是產物 ，分析同位素標記劑存在于物質分子的哪些原子上，可以進一步推斷各種物質之間的轉變機制。為了研究膽固醇的生物合成及其代謝，采用標記前身物的方法，揭示了膽固醇的生成途徑和步驟，實驗證明，凡是能在體內轉變為乙酰輔酶A的化合物，都可以作為生成膽固醇的原料，從乙酸到膽固醇的全部生物合成過程，至少包括36步化學反應，在鯊烯與膽固醇之間，就有二十個中間物，膽固醇的生物合成途徑可簡化為:乙酸→甲基二羥戊酸→膽固醇 又如在研究肝臟膽固醇的來源時，用放射性同位素標記物3H－膽固醇作靜脈注射的標記實驗說明，放射性大部分進入肝臟，再出現在糞中，且甲狀腺素能加速這個過程，從而可說明肝臟是處理血漿膽固醇的主要器官，甲狀腺能降低血中膽固醇含量的機理，在于它對血漿膽固醇向肝臟轉移過程的加速作用。

2.物質轉化的研究

物質在機體內相互轉化的規律是生命活動中重要的本質內容，在過去的物質轉化研究中，一般都采用用離體酶學方法，但是離體酶學方法的研究結果，不一定能代表整體情況，同位素標記技術的應用，使有關物質轉化的實驗的周期大大縮短，而且在離體、整體、無細胞體系的情況下都可應用，操作簡化，測定靈敏度提高，不僅能定性，還可作定量分析。 在闡明核糖苷酸向脫氧核糖核苷酸轉化的研究中，采用雙標記法，對產物作雙標記測量或經化學分離后分別測量其放射性。如在鳥嘌呤核苷酸（GMP）的堿基和核糖上分別都標記上14C，在離體系統中使之參入脫氧鳥嘌呤核苷酸（dGMP），然后將原標記物和產物（被雙標記GMP摻入的dGMP）分別進行酸水解和層析分離后，測定它們各自的堿基和戊糖的放射性，結果發現它們的兩部分的放射性比值基本相等，從而證明了產物dGMP的戊糖就原標記物GMP的戊糖，而沒有別的來源，否則產物dGMP的堿基和核糖的比值一定與原標記物GMP的兩部分比值有顯著差別。這個實驗說明戊糖脫氧是在堿基與戊糖不分記的情況下進行的，從而證明了脫氧核糖核苷酸是由核糖核苷酸直接轉化而來的，并不是核糖核苷酸先分解成核糖與堿基，堿基再重新接上脫氧杭核糖。無細胞的標記實驗可以分析物質在細胞內的轉化條件，例如以3H-dTTP為前身物作DNA摻入的標記實驗，按一定的實驗設計摻入后，測定產物DNA的放射性，作為新合成的DNA的檢出指標。

3.動態平衡的研究

闡明生物體內物質處于不斷更新的動態平衡之中，是放射性同位素標記法對生命科學的重大貢獻之一，向體內引入適當的同位素標記物，在不同時間測定物質中同位素含量的變化，就能了解該物質在體內的變動情況，定量計算出體內物質的代謝率，計算出物質的更新速度和更新時間等等。機體內的各種物質都在有大小不同的代謝庫，代謝庫的大小可用同位素稀釋法求也。

4.生物樣品中微量物質的分析

在放射性同位素標記技術被應用之前，由于制備樣品時的丟失而造成回收率低以及測量靈敏度不高等問題，使得對機體正常功能起很重要作用的微量物質不易被測定。近年來迅速發展、應用愈來愈廣泛的放射免疫分析（radioimmunoassay）技術是一種超微量的分析方法，它可測定的物質300多種，其中激素類居多，包括類固醇激素，多肽類激素，非肽類激素，蛋白質物質，環核苷酸，酶，腫瘤相關的抗原，抗體以及病原體，微量藥物等其它物質。

5.最近鄰序列分析法（Nearest neighbour-sequence analysis method）

放射性同位素標記技術，是分子生物學研究中的重要手段之一，對蛋白質生物合成的研究，從DNA復制、RNA轉錄到蛋白質翻譯均起了很大的作用。最近鄰序列分析法應用同位素標記技術結合酶切理論和統計學理論氚標記，研究證實了DNA分子中堿基排列規律，在體外作合成DNA的實驗：分四批進行，每批用一種不同的32P標記脫氧核苷三磷酸，32P標記在戊糖5'C的位置上，在完全條件下合成后，用特定的酶打開5'C－P鍵，使原堿基上通過戊糖5'C相連的32P移到最鄰近的另一單核苷酸的3'C上 。用最近鄰序列分析法首次提出了DNA復制與RNA轉錄的分子生物學基礎，從而建立了分子雜交技術，例如以噬體T2-DNA為模板制成[32P]RNA，取一定量T2-DNA和其它一些DNA加入此[32P]RNA中，經加熱使DNA雙鏈打開，并溫育，用密度梯度離心或微孔膜分離出DNA-[32P]RNA復合體測其放射性，實驗結果只有菌體T2的DNA能與該[32P]RNA形成放射性復合體。從而證明了RNA與DNA模板的堿基呈特殊配對的互補關系，用分子雜交技術還證實了從RNA到DNA的逆轉錄現象。此外，放射性同位素標記技術對分子生物學的貢獻還表現在：⑴對蛋白質合成過程中三個連續階段，即肽鏈的起始、延伸和終止的研究；⑵核酸的分離和純化；⑶核酸末端核苷酸分析，序列測定；⑷核酸結構與功能的關系；⑸RNA中的遺傳信息如何通過核苷酸的排列順序向蛋質中氨基酸傳遞的研究等等。為了更好地應用放射性同位素標記技術，除了有賴于標記劑的高質量和核探測器的高靈敏度外，關鍵還在于有科學根據的設想和創造性的實驗設計以及各種新技術的綜合應用